roky
admin
Pridružen/-a: 05.12. 2006, 19:16
Prispevkov: 345
|
|
 idelava gojišča za bakterije navezuje se na mikrobiologijo) |
 |
Tukaj je opisano kaj je gojišče za mikroorganizme
6 MIKROBIOLOŠKA GOJIŠČA
6.1 UVOD
V laboratoriju gojimo bakterije na gojiščih. Gojišče je tekoč ali trden pripravek, ki specifično služi rasti, shranjevanju ali transportu mikroorganizmov. Gojišča za gojitev mikroorganizmov morajo biti sterilna, zato jih steriliziramo ali sterilno pripravljamo in hranimo v sterilnih posodah. Če hočemo v/na takem gojišču gojiti mikroorganizme, moramo v/na gojišče dodati (inokulirati) majhno količino materiala, ki vsebuje žive celice (vcepek, inokulum). Inokuliran medij potem izpostavimo ustrezni temperaturi - ga inkubiramo. Inkubacija običajno poteka v termostatsko nadzorovanem prostoru ali omari (inkubator). Med inkubacijo mikroorganizmi rastejo in se delijo - razvije se mikrobna kultura.
Gojišča mikroorganizme oskrbujejo z ustreznimi viri energije, ogljika, dušika, kisika, fosforja, kalija, žvepla, magnezija (makrominerali), z mikrominerali, vitamini in rastnimi faktorji.
6.2 AVTOTROFI, HETEROTROFI
Večina bakterij, gliv in protozojev so heterotrofi, ogljik za izgradnjo svojih celic dobijo iz organskih spojin. Nekatere bakterije in alge pa osvajajo ogljik iz zraka (CO2) in jih imenujemo avtotrofi. Za sintezo celičnega materiala in za svoje vzdrževalne potrebe potrebujejo organizmi izvor energije. Pri zagotavljanju te potrebe so mikroorganizmi ubrali različne poti, od fotosinteze do oksidoreduktivnih poti, kjer so prejemniki elektronov različni (kisik, CO2, nitrat, sulfat, organske spojine). Če hočemo mikroorganizme gojiti v laboratoriju, moramo v gojišču zagotoviti vir energije in gradbene elemente za celico.
6.3 BISTVENE SESTAVINE GOJIŠČ
1. Izvor ogljika je lahko neorganski (CO2, HCO3) ali organski (npr. glukoza, acetat, piruvat za definirana gojišča in mesni ekstrakt, kvasni ekstrakt, pepton, tripton za kompleksna gojišča).
2. Izvor dušika je lahko organski (aminokisline, ekstrakti, hidrolizati) ali neorganski (NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3, N2
3. Fosfor: NaHPO4, KH2PO4
4. Žveplo: (NH4)2SO4, H2S
5. Kalij: KCl, K2HPO4
6. Magnezij: MgCl2, MgSO4
7. Natrij: NaCl
8. Železo: FeCl3, Fe(NH4)(SO4)2, železovi kelati
9. Sledovni elementi: CoCl2, ZnCl2, Na2 MoO4, CuCl2, MnSO4, NiCl2, Na2SeO4, Na2WO4, Na2VO4
6.4 VRSTE GOJIŠČ
Pri gojiščih razlikujemo naravna in umetna gojišča. Pri naravnih gojiščih, kot so krompir, korenje, sadni sok, serum, mleko, riž in dr. ne poznamo točne kemične sestave, taka gojišča niso standardizirana. Rast bakterij na takih gojiščih ni vedno enaka zaradi variabilnosti sestave. Danes naravna gojišča uporabljamo le izjemoma. Umetna gojišča so povečini sestavljena iz znanih kemičnih sestavin, so standardizirana in vedno enake kakovosti. Umetna gojišča lahko delimo v osnovna gojišča in posebna ali specialna gojišča.
Specialna gojišča pripravljamo iz osnovnih gojišč z dodajanjem posameznih komponent in med njimi ločimo:
- obogatena gojišča
- kompleksna gojišča,
- definirana gojišča,
- obogatitvena gojišča,
- diferencialna gojišča.
- minimalna gojišča (zadnja tri gojišča so selektivna gojišča)
Vsa ta gojišča so lahko pripravljena kot tekoča ali pa kot trdna gojišča. Ko tekočemu gojišču dodamo 1 do 2 % agarja dobimo trdno gojišče.
6.4.1. Osnovna gojišča
Osnovna gojišča (bazalno gojišče): sestavine zadoščajo za rast večine prehransko nezahtevnih heterotrofov (npr. E. coli). Nekateri mikroorganizmi v/na takih gojiščih ne rastejo, ker potrebujejo dodatek posameznih naravnih komponent kot so npr. serum, plazma, glukoza, ekstrakti naravnih substratov, ki izboljšajo in obogatijo gojišče. Taka gojišča so obogatena gojišča in jih uporabljamo predvsem takrat, kadar želimo gojiti mikrobe, ki so zelo prilagojeni svojemu naravnemu okolju.
Najbolj znana osnovna gojišča so:
- peptonska voda (1 % peptona, 0,5 % NaCl)
- hranilni bujon - HB (1 % peptona, 0,5 % NaCl, 1 - 0,5 % mesnega ekstrakta)
- hranilni agar - HA (hranilni bujon z 1,5 - 2 % agarja)
Pepton je vir proteinov, peptidov in aminokislin za rast mikroorganizmov. Je encimski (pepsin ali tripsin) hidrolizat mišičnine ali notranjih organov. Lahko uporabimo tudi druge proteinske hidrolizate (mlečni kazein, rastlinski proteinski viri). Pepton ne zagotavlja samo dušika, ampak je tudi nosilec ostalih hranljivih komponent, čeprav ne vedno v ustreznih količinah. Delno ogljikohidratne sestavine peptona lahko pokrijejo tudi energetske potrebe mikroorganizmov.
Mesni ekstrakt pridobijo s krajšim kuhanjem zdrobljene govedine (ali drugih vrst mesa) v vodi. Postopek izluži iz mesa lahko topne organske sestavine in soli. Pripravek posušijo. Mesni ekstrakt vsebuje veliko aminokislinskega dušika, peptidov, nukleotidov, sladkorjev, mineralov.
Agar - agar je polisaharid, ki v ustrezni raztopini tvori gel in nam tako omogoča pripravo trdnih gojišč. Pridobivajo ga iz nekaterih vrst morskih alg (Gelidium, Gracilaria, Pterocladia...). Raztopina agarja pri ohlajanju z vrelišča ostane tekoča do 45oC, strjen agar pa ostane čvrst tudi pri temperaturah, višjih od 50oC.
6.4.2. Definirana in kompleksna gojišča
Številna gojišča vsebujejo snovi (npr. pepton), katerih natančna sestava ni znana. Definirano gojišče pa je sestavljeno iz natančno odmerjenih količin čistih anorganskih ali organskih snovi, ki jih dodamo destilirani vodi. Tako je znana natančna kemična sestava takega gojišča. Definirano gojišče npr. potrebujemo, kadar študiramo prehranske potrebe neke bakterijske vrste.
Nasprotje definiranim gojiščem predstavljajo kompleksna gojišča, t. j. gojišča, ki imajo poleg definiranih mineralnih komponent dodane še naravne komponente, ki kemijsko niso popolnoma definirane (pepton, razni ekstrakti naravnih surovin).
6.4.3 Selektivna gojišča
Če dodajamo gojiščem take snovi, ki ustrezajo samo določenim vrstam bakterij, drugim pa zavirajo rast, jih imenujemo selektivna gojišča. Torej prednostno podpirajo rast določenih bakterij pred drugimi. Tak primer je npr. MacConkey-ev bujon, ki vsebuje žolčne soli. Te inhibirajo rast neenteričnih bakterij, enteričnih pa ne prizadenejo. To gojišče lahko uporabimo za izolacijo enteričnih bakterij, kadar imamo prisotna v inokulumu oba tipa mikroorganizmov. V nekem smislu so vsa gojišča selektivna, saj nikoli v enaki meri ne podpirajo rasti vseh bakterij.
Bogatitveno gojišče (imenujemo ga tudi namnoževalno gojišče, ker ga uporabljamo za namnožitev določenih vrst mikrobov) dovoljuje določeni vrsti mikroorganizmov, da preraste ostale mikroorganizme, ki so prisotni v inokulumu in sicer s podpiranjem rasti želene mikrobne vrste in/ali z inhibiranjem rasti neželenih vrst. Če npr. inokulum vsebuje le majhno število želene vrste mikrobov (znotraj velike populacije neželenih vrst) se z mikrobno rastjo v obogatitvenem gojišču poveča (obogati) delež želene vrste.
Na diferencialnem gojišču razlikujemo vrste bakterij po obliki ali barvi kolonij ali po drugih razlikah. Diferencialna gojišča vsebujejo enega ali več ogljikovih hidratov in indikator (barvila kot so npr. fenolno rdeče, lakmus, fenolftalein ...), ki spreminja barvo pri različnih pH vrednostih. Primer takega gojišča je npr. MacConkey-ev agar, kjer lahko ločimo kolonije E. coli od kolonij ostalih enterobakterij. Kolonije laktozo - uporabljajoče E. coli se obarvajo vijolično, ker se zaradi razgradnje laktoze spremeni pH gojišča (kislo), ta pa vpliva na pH indikator v gojišču. Enterobakterije, ki ne uporabljajo laktoze, fermentirajo pepton, katerega metabolni produkti reagirajo bazično in zato se njihove kolonije obarvajo rumeno.
Minimalna gojišča ne vsebujejo določenih rastnih faktorjev in ne omogočajo rasti nekaterih ali pa vseh avksotrofnih sevov (običajno mutant) določene mikrobne vrste, dovoljujejo pa rast prototrofnih sevov. Prototrofi so naravni, divji tipi (sevi) mikroorganizmov, avksotrofi pa so sevi mikroorganizmov, ki potrebujejo za svojo rast še eno ali več posebnih snovi (npr. aminokisline), ki jih sami ne morejo sintetizirati. Običajno so minimalna gojišča definirana gojišča.
_________________
 |
|
